Science：合成化学新思路——“虫内合成”

副标题：昆虫体内合成氧掺杂分子纳米碳

工作涉及合成化学相关领域的人们，可能对于各式各样的合成方法都习以为常，从常规的试管、烧瓶、反应釜，到超低温合成、微波合成、表面合成、界面合成，再到有关科学的酶促合成、细胞内合成，似乎各种能被用于合成分子的方式都被大家研究过了，难得有新方法能让人心中泛起波澜。那么，近期名古屋大学合成化学家Kenichiro Itami教授等人在Science 杂志发表的“虫内合成（in-insect synthesis）”概念，会不会让你眼前一亮？要知道，连Itami教授本人都在相关新闻报道中坦承：对大多数有机和合成化学家来说，“虫内合成”这个想法听起来“相当疯狂（pretty crazy）”。[1]

Kenichiro Itami教授与同事Takeshi Yanai、Kazuhiro J. Fujimoto、Atsushi Usami等研究者在该文中提出的“虫内合成”，指的是利用昆虫外源物代谢的优势来合成非天然产物。具体来说，他们将带状和环状分子纳米碳底物饲喂给斜纹夜蛾（Spodoptera litura）幼虫，可选择性地将其转化为氧原子插入芳香环的衍生物，这些衍生物目前用其他方法难以制备。对幼虫排泄物的检验表明，产率可达10%。进一步研究表明，细胞色素P450（CYP）变体很可能是主导相关转化反应的酶。分子动力学模拟和量子化学计算表明了底物与酶结合的可能模式，以及氧直接插入碳-碳键的非常规机制。

图1. 斜纹夜蛾幼虫体内转化分子纳米碳。图片来源：Science

作者选择亚甲基桥接的[6]环对苯撑（[6]MCPP）作为初始分子纳米碳底物，因为它具有刚性的带状结构、独特的细胞内化特性和商业可用性。用[6]MCPP喂养几种不同的昆虫，由于[6]MCPP的毒性，大多数昆虫都无法存活，只有斜纹夜蛾幼虫存活，适合进一步研究[6]MCPP的虫内转化。随后，作者给斜纹夜蛾幼虫饲喂含有[6]MCPP（200 nmol/幼虫）的人工饲料，收集新鲜粪便并进行提取。在该粗提取物中，除了剩余的未反应的[6]MCPP外，还鉴定出存在一种[6]MCPP衍生物。MALDI-TOF质谱法发现此种产物是氧加合物，因此将该产品命名为[6]MCPP-氧杂物（[6]MCPP-oxylene），分离产率为9.9±0.4%。该转化的选择性（底物特异性）很高，因为即使反应规模增加50倍，[6]MCPP-oxylene仍是唯一产物。在本文测试的任何条件下均未观察到二氧杂产物。作者通过单晶（图1D）揭示了[6]MCPP-oxylene的结构，其中氧原子是通过在五元环中亚甲基部分另一侧的C苯基-C苯基键断裂而插入的。[6]MCPP高度对称的带状结构在[6]MCPP-oxylene中明显变为椭圆形，固态下，[6]MCPP-oxylene排列整齐，堆叠填充环状结构内部，其中一个分子相对于另一个分子倾斜约90°。优化后的[6]MCPP-oxylene结构表现出Cs对称性，这与其1H-NMR吻合良好。氧掺杂对[6]MCPP骨架光学性质的影响可以从[6]MCPP-oxylene与[6]MCPP的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱中观察到（图1E）。[6]MCPP未观察到荧光，但[6]MCPP-oxylene在甲苯中室温下在510和539 nm处发荧光，荧光量子产率（ΦF）为0.13。[6]MCPP的结构上只是简单改变，但性质上却发生了很大变化，这凸显了虫内合成的潜力。为了验证[6]MCPP的氧掺杂是来自肠道菌、体内酶还是两者兼而有之，作者以肠道菌为靶点进行了生物转化实验。然而，发现肠道菌并未参与生物转化。

下一步，作者利用RNA测序全面分析了[6]MCPP取食对单个昆虫的影响，分析表明，[6]MCPP 的加速中和功能可归因于其被识别为外源物质或毒素。饲喂[6]MCPP后表达的基因数量增加（红色）或减少（蓝色）如图2A所示，观察到代谢相关途径的基因表达增加。基于涉及将单个氧原子插入[6]MCPP 的生物转化途径（图1B），作者重点研究了五种CYP变体，这些变体被认为参与了外源物质的代谢。定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）测试表明，这些CYP变体表现出与[6]MCPP摄食相关的不同基因表达水平（图2B），至少有三种CYP变体（CYP X2、X3和X4）参与了[6]MCPP的生物转化，这三种CYP变体的表达水平主要因[6]MCPP摄食和[6]MCPP-oxylene的产生而上调。注射siRNA后，饲喂[6]MCPP的斜纹夜蛾幼虫中各CYP基因表达水平与对照组相比分别降低了20%-80%，其中CYP X2和CYP X3的差异显著（图2D）。siRNA注射使[6]MCPP-oxylene的产率降低至4.4±1.9%（图2E）。这些结果支持CYP X2和CYP X3是参与[6]MCPP体内转化的关键酶。

图2. 斜纹夜蛾幼虫体内合成[6]MCPP-oxylene。图片来源：Science

确定了[6]MCPP在昆虫体内的氧掺杂转化后，作者设想斜纹夜蛾幼虫体内的反应或许可以扩展到碳纳米环[n]环对苯撑（[n]CPP）。他们以八种不同环尺寸的碳纳米环（[5]CPP至[12]CPP）为起始原料，并利用斜纹夜蛾幼虫进行生物转化。值得注意的是，斜纹夜蛾幼虫对CPP的生物转化是一个尺寸选择性反应，仅[6]CPP可以进行，其他CPP未发生反应。在其他条件相同的情况下，[6]CPP反应中，氧掺杂的[6]CPP（[6]CPP-oxylene）同样以5.8 ± 0.9%的产率从虫粪提取物中分离出来，同时分离出未反应的[6]CPP（50.0 ± 17.0%）。通过单晶证实了[6]CPP-oxylene的结构，其中单个氧原子插入到 CPP骨架的C苯基-C苯基键中。与[6]MCPP-oxylene的情况类似，分子的对称性从D3d对称（[6]CPP）变为C2对称（[6]CPP-oxylene）（图3B）。类似的，[6]CPP不发荧光，但[6]CPP-oxylene在室温下于甲苯中显示出以524 nm为中心的发射带，量子效率（ΦF）为0.26。与[6]MCPP的生物转化相比，CYP变体的基因表达水平略有不同，只有CYP X2显示出显著差异。CYP变体表达水平的这种差异表明[6]CPP比[6]MCPP具有更强的构象柔性，从而影响其与CYP的结合稳定性。这些结果支持CYP X2是参与[6]CPP体内转化的酶。

图3. [6]CPP在昆虫体内的转化。图片来源：Science

作者对[6]MCPP与CYP变体的结合亲和力进行了两步计算，以进一步了解反应机制。计算中选择CYP X3是因为其表达在[6]MCPP的生物转化过程中上调最多。结果表明，在1 μs的延长模拟时间内，[6]MCPP在CYP X3中保持稳定。对接和MD模拟证实了CYP X3能够稳定地容纳两个[6]MCPP分子。在MD模拟过程中，[6]MCPP中心与血红素铁之间距离随时间的变化显示平均距离为10.8 Å，标准差为0.42 Å，最后一个MD快照的距离为10.8 Å。[6]MCPP碳原子与血红素铁之间的最近邻距离为6.6 Å。这些结果证实了两个[6]MCPP分子与CYP X3的稳定结合。此外，研究结果表明，与仅引入一个[6]MCPP分子的情况相比，引入两个[6]MCPP分子时[6]MCPP-血红素距离缩短。在CYP X2中引入两个CPP分子时也观察到了类似的现象。作者还利用密度泛函理论计算，探究了P450反应循环活性物种化合物I（Cpd I）催化[6]MCPP转化为[6]MCPP-oxylene的反应机理。分析考虑了两种近简并自旋态：四重态和双重态，并分析了两种途径：环氧化和直接进攻（图4C）。作者认为，直接反应途径优于环氧化途径，因为与反应物复合物相比，它涉及的基元反应更少，活化自由能更低。与环氧化物产物相比，oxylene产物明显更稳定（稳定度 > 45 kcal mol−1），表明它是转化过程的热力学产物。实验和计算研究表明，[6]MCPP-oxylene是通过一种独特的生物途径生成的。最后，作者以类似于[6]MCPP转化的方式，研究了化合物I催化下[6]CPP转化为[6]CPP-oxylene的反应机理。该反应提出的路径与[6]MCPP的路径非常相似。决速步仍然是将氧插入[6]CPP 环，活化自由能约为 20 kcal mol−1。

图4. 底物与CYP变体的结合及氧掺杂机制。图片来源：Science

总结

名古屋大学的研究者们报道了一种令人惊诧的“虫内合成”概念，利用昆虫外源物代谢的优势来合成非天然产物。他们选择性地将带状和环状分子纳米碳转化为其他方法难以制备的、氧原子插入芳环的衍生物。其中，细胞色素P450变体很可能是该反应的关键酶。该方法不仅为纳米碳科学提供了新的工具箱和机遇，也为非天然产物合成打开了新的思路。

该概念的最大限制就是如何规模化。尽管这些肉乎乎的斜纹夜蛾幼虫很皮实，可以反复饲喂底物，但要大规模合成底物，难度还是不小。Itami教授表示，“如果要生产的是一公斤的产物分子，我都无法想象我们需要什么样的工艺、机器或设备。”[1] 此外，该研究还有一些地方没有讲的太清楚，比如，为什么[n]CPP底物只有[6]CPP可以转化，而其他尺寸的CPP无法转化？

在农林领域，斜纹夜蛾是一种臭名昭著的害虫，生命周期短，代谢农药的能力特别强，危害多种农作物及观赏花木。Itami教授说：“我们的项目中，斜纹夜蛾扮演了一个意想不到的角色——不是大反派，而是它们此前想都不敢想的英雄。”[2]